Una nueva técnica láser mejora la microscopía de espectro Raman-Brillouin

Existen diferencias obvias entre las células cancerosas y las células normales en términos de morfología, propiedades químicas y propiedades mecánicas. La detección de propiedades citoquímicas y mecánicas de tejidos tumorales puede proporcionar información multidimensional para el proceso patológico de células y tejidos humanos. Entre los métodos existentes para detectar la morfología, mecánica y propiedades químicas de tejidos y células, la espectroscopia Raman confocal permite la detección de propiedades químicas de microrregiones de muestras sin contacto ni etiqueta, y la espectroscopia Brillouin confocal permite detectar las propiedades mecánicas de microrregiones. -regiones de muestras sin contacto y no destructivas. Al combinar la espectroscopia Raman confocal con la espectroscopia Brillouin para detectar simultáneamente e in situ la morfología tridimensional, las propiedades químicas y las propiedades mecánicas de las microrregiones de los tejidos e incluso las estructuras subcelulares, debería proporcionar un nuevo medio para la detección de multidimensionales. Información patológica de tejidos y células.

La tecnología de imagen microscópica espectroscópica Raman/Brillouin confocal existente carece de capacidad de enfoque en tiempo real de alta precisión, por lo que el tamaño del punto enfocado en la muestra cambia con la fluctuación de la muestra en el proceso de escaneo, lo que limita el logro del espacial teórico. resolución del sistema de microscopía de espectro confocal. En segundo lugar, debido a los débiles espectros de dispersión de Raman y Brillouin y al largo tiempo de integración, el microscopio de espectro confocal se ve fácilmente afectado por la deriva del sistema y conduce al desenfoque, lo que afecta la resolución espacial y la calidad de la imagen. Además, cuando se utiliza para obtener imágenes de muestras de cortes de tejido biológico, la señal de fluorescencia generada por la incidencia vertical reducirá la relación señal-ruido del espectro Raman de la muestra, lo que afectará la precisión de la detección del espectro Raman y Brillouin. espectro y reduciendo la precisión de detección.

Por lo tanto, en un nuevo artículo publicado en Light Science & Application, un equipo de científicos, dirigido por el profesor Weiqian Zhao del Instituto de Tecnología de Beijing, propuso una nueva microscopía de espectro confocal Raman-Brillouin diferencial láser de apertura dividida (DLDCRBSM) con alta estabilidad. , capacidad antidispersión de alta resolución, como se muestra en la Figura 1(a), que ha otorgado la patente de invención china (ZL 201410086366.5) y la patente de invención europea (EP 3118608 B1). Al combinar la microscopía confocal diferencial láser de apertura dividida con la espectroscopia Raman y la espectroscopia Brillouin, se usó microscopía confocal diferencial para lograr un enfoque de precisión nanométrica de la muestra y mejorar la resolución espacial y la estabilidad, se usó tecnología de apertura dividida para suprimir eficazmente la interferencia de la capa de desenfoque de luz parásita y reflejada luces para mejorar la relación señal-ruido, y utilizó la detección separada de excitación coaxial y de alta resolución para lograr la estabilidad simultánea de imágenes de alto espectro y alta resolución espacial para topografía geométrica, espectros Raman y Brillion de la misma región.

Basado en el método propuesto, se desarrolla el microscopio de espectro confocal Raman-Brillouin diferencial de apertura dividida con alta resolución espacial y capacidad de seguimiento y enfoque de imágenes 3D, como se muestra en la Fig. 1 (b). Tiene una precisión de enfoque axial de 1 nm, una resolución de imagen espectral lateral superior a 400 nm, una resolución de detección de espectro Raman de 0,7 cm.^-1 y una resolución de detección de espectro Brillouin de 0,5 GHz.

El microscopio de banco de trabajo se utilizó para la muestra de polimetilmetacrilato (PMMA) en forma de banda sobre sustrato de Si y obtuvo imágenes claras de la muestra debido a su enfoque axial en tiempo real, que se muestra en la Fig. 2 (a). Por lo tanto, se ha verificado que el método propuesto tiene la capacidad antideriva. El microscopio de banco de trabajo se utilizó para la muestra transparente de doble capa con la capa superior de PMMA y la capa inferior de SiO.₂, y las medidas se muestran en la Figura 2(b). La figura 2(b) indica que el microscopio establecido tiene la capacidad de suprimir la interferencia de luz parásita desenfocada.

El mapeo Raman y Brillouin de los tejidos cancerosos gástricos y los tejidos normales adyacentes se realizó utilizando el microscopio de espectroscopia confocal diferencial desarrollado. Los resultados confirmaron la hipótesis anterior de que los cambios en las sustancias proteicas en los tejidos cancerosos y los cambios en la viscoelasticidad del tejido conducen a una mayor invasividad.

La figura 3(a) muestra los resultados de las imágenes químicas del tejido canceroso gástrico y su tejido normal adyacente mediante este microscopio de espectroscopia confocal diferencial, y la concentración se caracteriza por la intensidad máxima característica de los espectros Raman. En comparación con los tejidos normales adyacentes, la concentración de colágeno en los tejidos cancerosos gástricos fue baja y la distribución fue discreta. La concentración de material de ADN en las células de cáncer gástrico es alta y el rango de distribución es amplio. La concentración de proteína en la matriz celular de los tejidos de cáncer gástrico fue baja. La concentración de lípidos en tejidos cancerosos gástricos es alta en la matriz, mientras que la distribución de lípidos en tejidos normales es relativamente uniforme.

La Figura 3(b) muestra los resultados de las imágenes de las propiedades mecánicas del tejido canceroso gástrico y el tejido normal adyacente mediante el microscopio de espectroscopia confocal diferencial. El cambio de frecuencia del espectro de Brillouin representa el módulo de almacenamiento de energía (es decir, la elasticidad) de una sustancia, mientras que el ancho completo a la mitad del máximo del espectro de Brillouin representa el módulo de pérdida (es decir, la viscosidad) de una sustancia. En comparación con los hallazgos de imágenes mecánicas de los tejidos normales adyacentes, la elasticidad de las células cancerosas gástricas y la sustancia intercelular fue menor, y la elasticidad del núcleo de las células cancerosas fue mayor. La adhesividad de las células de cáncer gástrico y el problema t intersticial fue menor, y la adhesividad del núcleo de la célula cancerosa fue mayor.

En este estudio, se propuso un método de obtención de imágenes de espectroscopia confocal diferencial Raman-Brillouin láser de alta estabilidad, alta resolución y antidispersión, y se desarrolló con éxito el instrumento correspondiente para detectar la morfología tridimensional, las propiedades mecánicas y la información multidimensional de las muestras. y se ha utilizado en el análisis de caracterización de tejidos tumorales para verificar su aplicación. Este método puede proporcionar un nuevo método para la investigación del proceso del cáncer y el tratamiento del cáncer.