La capsaicina induce la ferroptosis del NSCLC al regular la señalización de SLC7A11/GPX4 in vitro

Cultivo celular y prueba MTT

Las células A549 y NCI-H23 se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.). Cultivamos estos dos tipos de células con medio Eagle modificado con alto contenido de glucosa de Dulbecco (DMEM; Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) y suero bovino fetal al 10 % (FBS; Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) en un ambiente humidificado de 5 % CO2₂ a 37°C.

Células A549 y NCI-H23 (1 × 10⁴ células/pocillo) se cultivaron en placas de 96 pocillos y se trataron con concentraciones de capsaicina de 0, 50, 100, 200 y 300 μM (A10178, AdooQ) durante 24 y 48 h, respectivamente. Después de tratarse con capsaicina, se añadió MTT (5 mg/mL en PBS, 10 µL, Sigma-Aldrich) a cada pocillo y se cultivó a 37 ℃ durante 3 h sin luz. Luego se descartó el sobrenadante y los cristales de formazán formados se disolvieron en 100 μL de sulfóxido de dimetilo al 100% (DMSO, Sigma-Aldrich). Finalmente, se detectó la absorbancia a 570 nm utilizando el analizador (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.). Los valores IC50 para células A549 y NCI-H23 tratadas con capsaicina se determinaron para los siguientes estudios. Para diferenciar entre apoptosis y ferroptosis, usamos ferrostatina-1 (Fer-1, un supresor de ferroptosis, Sigma-Aldrich, 1 μM) y Z-VAD-FMK (ZVF, un supresor de apoptosis, Sigma-Aldrich, 100 μM) , y observaron cambios en la viabilidad de las células A549 y NCI-H23 respectivamente. Las concentraciones de Hierro-1 y ZVF aquí se decidieron de acuerdo con informes anteriores.^21.22.

Después de confirmar los valores IC50 de las células A549 y NCI-H23, las células se dividieron en 3 grupos respectivamente para la siguiente investigación: (1) grupo de control, (2) grupo de capsaicina, (3) grupo de capsaicina + ferrostatina -1.

Detección de la concentración de hierro

Detectamos niveles de hierro total en cada grupo de células A549 y NCI-H23 utilizando el kit de ensayo de hierro (MAK025, Sigma-Aldrich) según el manual del usuario.

Fe²⁺ ensayo

Detectamos niveles de hierro divalente en cada grupo de células A549 y NCI-H23 aplicando el kit de ensayo de hierro (ab83366, Abcam, Reino Unido) según el manual del usuario.

dosis de GSH

Los niveles de GSH en cada grupo de células A549 y NCI-H23 se evaluaron aplicando un kit de prueba de GSH (BioVision Inc., Milpitas, CA, EE. UU.) de acuerdo con el manual del usuario.

Extracción de ARN total y PCR en tiempo real

Métodos similares a los publicados en informes anteriores²³, se aisló el ARN total de cada grupo de células A549 y NCI-H23 respectivamente. Los niveles de ARNm de SLC7A11 y GPX4 se analizaron mediante PCR en tiempo real utilizando Power SYBR™ Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Las condiciones de PCR fueron: 1 ciclo de 2 min a 50°C y 2 min a 95°C, 40 ciclos de 15 s a 95°C y 1 min a 60°C. Las expresiones relativas de los genes se normalizaron a GAPDH, y las relativas al calibrador se dieron mediante la fórmula 2^−ΔΔCt. Se utilizaron los siguientes pares de cebadores para PCR en tiempo real: GPX4 5′-AGA GAT CAA AGA GTT CGC CG-3′ directo, 5′-TTG TCG ATG AGG AAC TGT GG-3′ inverso; SLC7A11 delantero 5ʹ-GGA TTG GCT TCG TCA TCA CT-3ʹ, trasero 5ʹ-ATA ATC AAC CCG CGG TAC TC-3ʹ; GAPDH delantero 5ʹ-TGT TCG TCA TGG GTG TGA AC-3ʹ, trasero 5ʹ-ATG GCA TGG ACT GTG GTC AT-3ʹ.

Análisis de Western Blot

Western blot se implementó como los procedimientos informados por Fathi et al.²⁴. Extrajimos proteínas de cada grupo de células A549 y NCI-H23 utilizando el tampón de extracción de proteínas RIPA (Beyotime, Shanghai, China). Usando el kit de prueba de proteína BCA (Beyotime, Shanghai, China), detectamos concentraciones de proteína. A continuación, separamos y sometimos a electrotransferencia cantidades iguales de proteína (40 μg) de cada muestra en membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Después de bloquearlas e incubarlas con los anticuerpos primarios, las membranas se incubaron con los anticuerpos secundarios. En el experimento, usamos los anticuerpos de la siguiente manera: anticuerpo anti-SLC7A11 (1:1500, ab175186, Abcam), anti-GPX4 (1:2000, ab125066, Abcam), anticuerpo anti-β-actina (1:1000, ab8227 , Abcam). Finalmente, la detección se realizó por quimioluminiscencia (Millipore Corporation, Temecula, CA, EE. UU.).

análisis estadísticos

El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism (versión 8.0). Los datos obtenidos de cada experimento in vitro se presentaron como media ± DE. Las diferencias se identificaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la prueba post hoc de Tukey, y PAGS<0,05 se consideró significativo. Todos los experimentos se repitieron tres veces de forma independiente.